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ELISA不得不懂的實驗原理

發布時間: 2022-02-16  點擊次數: 103次

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。

在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。

由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度類型及步驟

ELISA的主要常用類型及步驟

1. 間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:

1)將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原,洗滌除去未結合的抗原及雜質。

2)加稀釋的樣本,保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關。

4)加底物顯色。

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2. 雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法,操作步驟如下:

1)將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

2)加受檢樣本,保溫反應。樣本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

3)加酶標抗體,保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關。

4)加底物顯色。

3. 雙抗原夾心法測抗體

反應原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體

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4.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

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